单细胞搭配微生物组怎么玩？快来围观！|单细胞专题

上一期我们介绍了Nature杂志的高阶玩法—单细胞搭配肠道菌群+代谢组，构建了肠-脑轴在动物行为学的机制方案，详见肠道菌群搭配单细胞在一起就能发Nature？| 单细胞专题。本期我们继续解析单细胞搭配微生物组怎么玩？今天这篇联川的用户文章由浙江大学动物科学学院孙会增课题组发表在Microbiome杂志，利用宏基因组研究了代谢纤维素的瘤胃菌群，再通过单细胞RNA测序方法探究吸收这些代谢脂肪酸的上皮细胞类群。详细解析如下：

期刊名称：Microbiome

影响因子：14.65

发表时间：2022.1.20

所用组学：单细胞转录组测序（联川提供）、宏基因组

研究背景

满足对优质动物蛋白的需求已成为全球粮食安全问题。乳制品是最佳的动物蛋白制品，全球年人均乳制品消费量超过100公斤。奶牛利用人类不可食用的低价值植物生物质来生产牛奶，这是一种具有丰富营养和高蛋白质的低成本产品。

奶牛蒋草料转换为牛奶的这一过程依赖瘤胃微生物发酵木质纤维素和纤维素产生挥发性脂肪酸 (VFA)。VFA的产生与奶牛瘤胃中的共生微生物群息息相关，微生物将纤维素分解并用于VFA的生产。不同分类特征和功能的微生物会影响VFA的产生。VFA产生后由瘤胃复层鳞状上皮吸收并部分代谢，该上皮由多种细胞类型介导。研究VFA的产生和被宿主吸收的过程对于提高动物生产效率至关重要。

数据结果

微生物组成分类

本文作者根据浙江大学的动物研究指南在中国杭州同一地区的商业奶牛场选择了52头荷斯坦泌乳牛，筛选后对其中49头泌乳牛的瘤胃内容物进行采集，提取DNA后进行宏基因组测序。通过低质量数据去除、注释、组装，最终得到186个瘤胃微生物基因组（MAG）。根据Parks等人提出的高质量MAGs定义，92个MAGs接近完成（完整性≥90%），94个MAGs基本完成（70%≤完整性≤90%），有 71 个显示出较低的污染（污染 < 5%）。

对 MAGs 进行分类分配发现大多数属于未培养的谱系，没有有关代谢或系统发育特征的数据。在分类学上可归类为 5 个门：拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和鲎菌门。在目水平，可分类为拟杆菌目，梭菌目、红蝽杆菌目、双歧杆菌目、Elusimicrobia和香蕉孢菌目。

图1基于宏基因组分箱分析从 49 头奶牛中回收的 186 头瘤胃 MAG 的概况

通过宏基因组分析数据可知仍有大量未分类的微生物基因组定位到物种水平，许多MAG仅在界水平上得到解析，仍有大量微生物基因组有待测序和组装。

宏基因组数据预测CAZyme 模块

植物纤维的分解由瘤胃微生物的降解酶引发，包括能够降解纤维素、木聚糖（半纤维素）和果胶的酶。作者基于宏基因组数据集和 MAG进行CAZyme的预测，以表征奶牛瘤胃中碳水化合物活性酶的特征。将宏基因组预测得到的CAZyme数据与CAZy 数据库比对后发现未知细菌的CAZymes数量最多，其次是拟杆菌门和厚壁菌门。CAZyme在细菌门中的分布表明在大多数门和未知菌类的CAZyme中占比较多的为GHs、GTs和CEs 。

图2 瘤胃微生物基因组预测的CAZyme 图谱

瘤胃中拟杆菌门微生物的纤维降解能力

根据之前的微生物基因组数据揭示了拟杆菌门在瘤胃碳水化合物降解中承担了重要的作用，从基因组信息可以得知该优势菌能够编码结合和消化多种碳水化合物底物的蛋白质。因此研究人员分析了54种拟杆菌MAG中GH模块的分布以及纤维素降解、果胶降解和木聚糖降解的重要纤维降解能力。

多糖利用基因座 (PUL)即编码细菌结合、运输和解聚特定聚糖结构所必需的酶的基因簇。PUL对一种特定或多种底物具有特异性，因此在通过微生物基因组分析得到的PUL 可用于预测微生物作用底物的预测。研究者检测了拟杆菌属MAG中的 PUL，共鉴定出 1827个PUL。在这些拟杆菌属MAG 中，50 个含有多个 PUL，每个MAG的PUL数量从1到87个不等。PUL数据显示，最常见的与 CAZyme 相关的PUL是那些参与木聚糖降解 (GH43)、果胶降解 ( GH28)、淀粉降解 (GH13 和 GH97) 以及参与植物多糖消化和碳水化合物降解的辅助酶 (GH2、GH15、GH32)。在目前的研究中，拥有最多 PULs 的反刍动物表明这一支系具有很高的多糖降解潜力，这使得多种底物可以在荷斯坦奶牛瘤胃中使用，并可能作为一个重要的中间代谢物参与牛奶的生物合成

图3拟杆菌门MAGs的多糖降解潜力

泌乳奶牛瘤胃上皮单细胞图谱

研究人员对来自 3 头泌乳荷斯坦奶牛腹侧瘤胃组织的 20,728 个高质量个体上皮细胞进行了 scRNA-seq 分析。研究人员在泌乳奶牛中检测分析得到18个瘤胃上皮细胞簇。簇11、13和16是增殖的基底细胞，并进一步分为三个亚群（TROAP + MC、RRM2 + MC 和 MC_1）。簇3、6、7 和 12 高度表达基底细胞 (BC) 标记KRT14或KRT5，并被定义为BC的四种亚型（KRT5 + BC_1、KRT5 + BC_2、KRT14 + KRT5 + BC_1 和KRT14 + KRT5 + BC_2）。簇 0、4、5、8 和 14 是具有高水平DLK2的颗粒细胞 (GC) 类型，其表达仅限于颗粒层，是角化细胞终末分化和角化的关键调节因子。簇1、2、 9被预测为三种棘细胞亚型 (SC_1-3)，因为它们不表达基底细胞标志物（如KRT14和KRT5），但略微表达棘细胞标志物KRT10或颗粒细胞标记DLK2。

图4 泌乳荷斯坦奶牛瘤胃上皮单细胞图谱

除了高水平的棘细胞标记基因KRT10、S100A8和KRT6A 外，簇 10、15和17特异性表达GJA1（通道间隙细胞基因标记）。因此，它们被定义为cg样 SCs（通道间隙样棘细胞），通过免疫荧光染色可进一步得到验证。在这三种 cg 样 SCs 中，高表达的FABP4（一种脂肪酸结合蛋白基因）表明它们参与了脂肪酸的吸收、转运和代谢。

瘤胃上皮细胞亚型的 VFA 代谢异质性

阴离子交换机制在 VFA 从管腔吸收到上皮细胞并挤出到血液中发挥着至关重要的作用。阴离子交换依赖性和阴离子交换非依赖性VFA转运的分子候选物有很多，包括 SLC16A、SLC26A、SLC22A、SLC21A、SLC4A和SLC5A家族。研究人员分析了上述家族内基因在每种细胞类型中的表达，发现这些基因的表达模式是细胞类型特异性的。如SLC16A9主要存在于BC亚型、SLC4A7在 GC_5中特异性地高表达。

数据分析表明VFA可能很少被GC相关的细胞亚型吸收，即使这些细胞是在解剖学上首先接触瘤胃管腔中产生的 VFA的活细胞。KRT5 + BC_2、TM4SF1 + cg-like SC和IGFBP5 + cg-like SC高度表达了编码VFA转运蛋白的候选基因，在VFA摄取中发挥了重要的作用。VFAs通过颗粒细胞到达基底层和棘层细胞的机制需要进一步阐明。

图5 编码所有瘤胃上皮细胞亚型的VFA 吸收和代谢转运蛋白的基因表达图

VFA代谢是瘤胃上皮细胞利用VFA的另一个重要功能。研究人员研究了瘤胃上皮细胞类型中与 VFA 代谢相关的基因模式（ACSS1、ACSS2、ACSS3、ACAT1、ACAT2、HMGCS2、HMGCL和BDH1 ）。结果表明TROAP + MC、MC_1、KRT14 + KRT5 + BC_2、KRT5 + BC_2、TM4SF1 + cg-like SC、BPIFA2C + cg-like SC，尤其是IGFBP5 + cg-like SC 是主要的VFA代谢细胞亚型。基因集评分分析进一步证实了这一点。

结论

在瘤胃系统中，纤维的利用是通过微生物代谢和上皮细胞功能的相互联系来实现的。根据上述的实验结果，研究人员绘制了通俗易懂的模式图来阐述中间的机制。

微生物代谢与瘤胃上皮细胞相互作用的模型

该研究在瘤胃中发现了分别参与纤维消化、VFA 摄取和代谢的关键个体微生物基因组和上皮细胞亚型。这些数据的整合使研究人员能够将微生物基因组和上皮单细胞与营养系统联系起来。

参考文献

Xue MY, Wu JJ, Xie YY, et al. Investigation of fiber utilization in the rumen of dairy cows based on metagenome-assembled genomes and single-cell RNA sequencing. Microbiome. 2022;10(1):11. Published 2022 Jan 20. doi:10.1186/s40168-021-01211-w

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